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超快光子实时荧光定量pcr原理和步骤

作者:广东正发科技有限公司 1435 次浏览 时间:2022-09-20

信息摘要:过聚合酶链反应(PCR)进行核酸扩增和定量是临床实验室、精准医学、个性化医疗、农业科学、法医学和环境科学中最灵敏、最强大的工具之一。超快多重 PCR 具有低功耗、体积小、操作简单等特点,非常适合在床旁 (POC) 进行及时诊断。尽管已经提出了几种快速/超快PCR方法,但对于POC......

超快光子荧光定量 PCR

抽象

通过聚合酶链反应(PCR)进行核酸扩增和定量是临床实验室、精准医学、个性化医疗、农业科学、法医学和环境科学中最灵敏、最强大的工具之一。超快多重 PCR 具有低功耗、体积小、操作简单等特点,非常适合在床旁 (POC) 进行及时诊断。尽管已经提出了几种快速/超快PCR方法,但对于POC检测而言,使用简单而可靠的PCR热循环仪仍然具有挑战性。在这里,我们提出了一种超快光子PCR方法,该方法使用等离子体光热光热转换,通过光子 - 电子 - 声子耦合。我们展示了一种使用薄金(Au)薄膜的高效光子热转换器,因为它具有等离激元辅助的高光学吸收(在450nm处约为65%,这是热源发光二极管(LED)的峰值波长)。等离子体激发的Au膜能够在3分钟内将周围的溶液快速加热到150°C以上。使用这种方法,超快热循环(30次循环;加热和冷却速率为12.79±0.93°C s1和 6.6±0.29 °C 秒1分别)在5分钟内完成从55°C(退火温度)到95°C(变性温度)。使用光子PCR热循环,我们在这里展示了成功的核酸(λ-DNA)扩增。我们简单、稳健和低成本的超快PCR方法使用高效的基于光子的加热程序,通常可以集成到各种设备或程序中,包括片上热裂解和等温扩增加热。

介绍

聚合酶链反应(PCR)自1983年由Kary Mullis首次发明以来,已成为临床实验室,农业科学,环境科学和法医学领域的基本技术。 PCR需要热循环,或在两个或三个离散温度之间重复温度变化,以扩增特定的核酸靶序列。为了实现这种热循环,传统的台式热循环仪通常使用由珀尔帖元件供电的金属加热块。虽然商用PCR系统提高了加热和冷却速率以减少扩增时间,但它们仍然相对耗时(通常每次扩增需要一个小时或更长时间)。这可以归因于系统的热电容较大,需要均匀加热96孔或384孔塑料PCR板,每孔反应体积为几十微升。

由于快速/超快PCR对于传染病、心脏病、癌症、神经系统疾病以及即时生物战和病原体鉴定(POC)级别的快速诊断等应用非常理想,因此许多学术和工业团体致力于改进PCR系统,一个商用 PCR 系统(LightCycler 2.0,罗氏诊断美国,印第安纳波利斯,美国印第安纳州)使用空气加热/冷却和毛细管,可在 10–60 分钟内执行 30 次热循环,具体取决于样品体积。®10但是,由于其高功耗(最大800 W)和重(约22 kg)而不适合POC测试。对于在资源有限的环境中(如发展中国家)用于全球医疗保健的POC诊断,快速/超快PCR系统应是便携式的、稳健的、简单的、易于使用的,并且通过小型化和集成实现低功耗。

迄今为止,基于微流体的快速/超快PCR系统已经过广泛研究,通过减少样品量和提高传热速率来缩短扩增时间。使用微细加工薄膜加热器的电阻加热最常用于控制静态微流体PCR系统中的温度,其中PCR在微流体室中运行。然而,这种方法需要复杂的制造工艺来集成芯片上的薄膜加热器和电阻温度检测传感器。在芯片上进行连续流动PCR的情况下,当反应样品通过三个离散的温度区时,就会发生PCR扩增。13该方法可以产生更快的PCR热循环,但需要外部注射泵进行连续流量控制,并且缺乏同时进行多种反应的能力。另一种方法包括红外介导的非接触式选择性加热水滴(纳升样品体积),以使用红外激光进行超快热循环,其利用波长超过1000nm的水的强吸光度。然而,从PCR混合物中形成液滴是一个容易出现人为错误的精确过程,这是POC测试的一个缺点。

最近,人们努力利用等离子体光热加热金纳米颗粒的优势,使用脉冲或连续波激光激发进行癌症的光热治疗和快速聚合酶链反应,例如。然而,这种安排对于POC测试并不理想,因为它不仅需要昂贵的激光和检测系统,而且还缺乏可靠的基于金纳米颗粒的样品制备。

在本文中,我们提出了一种新颖的超快光子PCR方法,该方法结合了使用薄的Au膜作为光热转换器和发光二极管(LED)作为热源。由于等离子体光热光转换,在薄的Au膜上通过光子 - 电子 - 声子耦合产生热等离子体光热转换,然后加热周围的溶液,最高温度超过150°C在3分钟内产生热量。30 次超快热循环(加热速率为 12.79±0.93 °C s1冷却速度为 6.6±0.29 °C s1)从55°C(退火点)到95°C(变性点)在5分钟内完成。使用这种技术,我们成功地证明了λ-DNA的扩增。我们建议我们的PCR系统具有超快的热循环能力,多重PCR,低功耗(在当前设置中,高达约3.5 W),低成本和简单的系统级集成配置,因此非常适合POC诊断。此外,我们高效的基于光子的加热程序通常可以集成到各种器件或程序中,包括片上热裂解和等温放大加热。


材料和方法

稀疏的金膜沉积聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)PCR孔的制备

使用VersaLASER VL-200激光切割系统(通用激光系统公司,美国亚利桑那州斯科茨代尔)切割4毫米厚的PMMA板材,以产生直径为4毫米的反应井。将1.5 mm厚的底部PMMA片和顶部反应井在PMMA片上进行84°C的热键合,压力为1.0 t,经过10分钟的UV/臭氧处理10 min×。7托。将2 μL聚二甲基硅氧烷滴入井中,在烘箱中固化2 h,防止金薄膜被薄膜和热电偶抑制PCR反应,用薄聚二甲基硅氧烷钝化。

模拟

我们使用 COMSOL 多物理场软件(版本 4.3,COMSOL 公司,美国马萨诸塞州伯灵顿)进行电磁仿真。仿真的详细几何形状和材料属性如附图所示。S1  S1。将一层薄的金膜放在PMMA基板上,然后用水覆盖金膜。将不同厚度(10、20、40、80和120 nm)的金膜应用于仿真,以计算金膜的吸收和随后的电阻热产生。具有x极化电场的平面波在补充图所示的坐标系中沿正z方向行进。S1.本研究中使用的Au介电常数来自约翰逊和克里斯蒂,21PMMA和水的介电位数分别为3和1.77。

超快光子荧光定量 PCR 循环

LED(Luxeon Rebel,Luxeon Rebel,加利福尼亚州圣何塞,美国,皇家蓝,峰值波长为447.5 nm,700 mA注入电流下为890 mW)用于用Keithley 2400源米对稀薄的Au薄膜进行等离子体光热加热。为了聚焦来自LED的光,使用了Carclo 20 mm光纤耦合光学器件(部件号:10356,美国宾夕法尼亚州卡克洛光学)。从OMEGA工程公司购买的K型绝缘热电偶(部件号,5SC-TT-K-40-36)实时监控和记录溶液的温度,以进行热循环。使用 LED、 80 mm 冷却 风扇、 源 极 计 和 热 电 偶 进行 温度 循环 通过 LabVIEW 程序 进行 控制。NI 9213 16 通道 热电偶 模块 具有 高速 模式、 自动 归零 和 冷 结 补偿 功能, 用于 从 K 型 热电偶 进行 精确 的 温度 采集。®

PCR试剂和DNA模板的制备

模板λ-DNA和塔卡拉Z-塔克断续器DNA 聚合酶(2.5 U 微升)1), 10× Z-Taq 缓冲液 (毫克2+此外,30 mM)和dNTP混合物(各2.5 mM)是从宝良生物公司(日本SHG大津市)购买的。正向引物(5′-猫链三磷酸三聚一乳三噻用Z-Taq扩增98碱基对(bp)λ-DNA靶标的反应断续器DNA聚合酶包括0.5μLZ-Taq DNA聚合酶,5μL10×Z-Taq缓冲液,4μLdNTP混合物,4.5μL10μM引物(每个)和10μL牛血清白蛋白(50μg),并用PCR级水送至50μL。模板 λ-DNA 的最终浓度为 0.1 ng μL1.将10μLPCR混合物置于Au包被的PMMA PCR孔中以进行光子PCR,然后用30μL矿物油覆盖以防止在热循环过程中蒸发。扩增后,将10 μL PCR产物和10 μL E-Gel样品上样缓冲液(Invitrogen,赛默飞世尔科学公司,马萨诸塞州沃尔瑟姆,美国)的混合物加载到带有SYBR Safe的E-Gel 2%琼脂糖凝胶上®®断续器DNA凝胶染色(维特显)并在E-Gel碱基(维特质)中电泳30分钟。使用1-Kb DNA分子量标准品来确认产物的大小。

结果和讨论

用于 PCR 的光热光热转换

超快光子PCR的原理如图1a所示。在考虑光子与材料的相互作用时,光子的吸收通常被视为热量。22当来自激发源的光子到达薄的Au膜表面时,等离子体辅助的强光吸收可能发生。反过来,这会将表面附近的电子激发到更高的能量状态,在100 fs内产生热电子。这些热电子由于其电子热容量小,可以达到几千开尔文的温度。它们还能够在整个薄膜中快速扩散,从而产生热电子的均匀分布。快速加热后,通过热电子和晶格声子之间的能量交换冷却到平衡,在5-10 ps之后。因此,总体而言,当薄膜被照亮时,热金属表面与较冷的周围溶液之间发生较大的温差,导致周围溶液在超过100 ps的长时间范围内加热。当灯关闭时,加热溶液的快速冷却也可以通过具有317 W m高导热性的薄金膜散热来实现1K1.25沉积在PMMA井上的薄金膜用作光热转换器,用作PCR热循环的等离子体光热加热源,如图1b所示。除了使用单个LED驱动多个PCR反应外,还可通过调制每个LED以对各种引物设计具有独特的退火温度,将集成在LED阵列中的多个孔板用于多重PCR。这种多孔 LED 阵列 PCR 热循环仪配置非常适合用于 POC 诊断的多路超快 PCR,因为它可以同时执行多个测试


PCR 1.jpg

超快光子荧光定量 PCR。

a)等离子体光热光热转换的示意图,以及随后通过超快光子-电子-声子偶联对周围溶液(此处为PCR混合物)的加热。当灯关闭时,可以通过薄金膜的散热来实现加热溶液的快速冷却。

b) 使用薄金(Au)薄膜作为光热转换器和LED激发光的超快光子PCR示意图。通过PCR进行核酸扩增需要热循环,包括两个或三个离散温度以进行变性,退火和延伸。对于多次PCR反应,每个LED可以单独调制,以便每个引物设计都有独特的退火温度。发光二极管,发光二极管;聚合酶链反应,聚合酶链反应。

 

我们进行了一组电磁模拟,以理论上表征我们的Au薄膜的等离子体光热光热转换。我们计算了PMMA基板上10 nm和120 nm厚的Au薄膜的电磁场和电阻热分布。正如从集肤深度所期望的那样,  其中ω是角频率,μ是渗透率,σ是电导率;薄金膜的厚度决定了光到热的转换量。在450nm波长光源的正常入射下,10nm厚的Au膜传输大量的电磁能量(图2a),并且热转换能量沿着膜深度饱和(图2c)。然而,120nm厚的Au膜吸收了大部分入射光(图2b),随后通过将光转换为热量在Au膜中产生更多的热量(图2d)。图2e显示,在10-120nm范围内,薄膜厚度的增加对应于光学吸收的增加。在540nm波长以下的光学吸收显着增加可归因于金的等离子体电子共振。26因此,对于三个不同的LED,每个LED的发射波长内的平均光热转换效率随着Au膜厚度的增加而增加,如图2f所示(参见补充图。S2)。值得注意的是,峰值发射波长为450 nm的蓝色LED使用金膜显示出最高的光热转换效率。

PCR 2.jpg


模拟使用电磁辐射的薄金膜产生的热量。计算PMMA基板上a)10 nm和(b)120 nm厚的Au薄膜的电磁场分布。光的波长为450 nm,具有正常的入射角。PMMA基板上(c)10纳米和(d)120纳米厚的金膜的相应电阻热分布。(e) 计算出不同厚度的金薄膜的吸收光谱。(f) 作为金膜厚度的函数,在三个不同LED的发射波长上平均的金薄膜的光热转换效率。峰值波长为450 nm的蓝色LED显示出最高的平均光热转换效率。发光二极管,发光二极管;聚甲基丙烯酸甲酯。

 

发光二极管驱动的光子PCR热循环仪

沉积在PMMA基板上的不同厚度的薄膜的光学吸收光谱如图3a所示(参见附图。S3)。我们的仿真结果可以帮助我们确定何时发生最强的光吸收,因为这对于最大化光热加热至关重要。随着稀金膜厚度的增加,光学吸收也增加,在120nm厚的Au膜中,在激发LED的峰值波长(450nm)处显示出65%的吸收。我们的光子PCR热循环仪使用LED作为加热源,PMMA PCR孔沉积有薄的Au膜,以及用于聚焦激发光的透镜(见补充图。S3)。来自LED的光是连续波和随机偏振的。因此,在这种情况下,光热转换的效率将低于使用脉冲激光器,因为当电子被激发到更高的能量状态时,进一步激发的可能性会降低。尽管LED的光热转换效率可能低于脉冲光源,但与激光光源相比,LED需要的功耗最低,成本极低,使其成为POC测试的理想PCR热源。超快光子PCR热循环仪器的元件成本(见附图。S3b) 的 价格 可能 低于 100 美元, 包括 LED、 聚焦 镜头 和 驱动 器, 如果 将 LabVIEW 和 用于 温度 控制 的 数据 采集 板 集成 到 单 片 机 模 块 中。在 1 A 注入电流下,LED 的最大功耗约为 3.5 W。图3b显示了在500 mA的固定注射电流下,不同厚度的薄膜上10μL体积的溶液(此处使用甘油来显示最大加热温度)的温度曲线。由于光学吸收的增加,随着薄膜的厚度从10 nm增加到120 nm,最高温度升高。如图3c所示,120nm厚的Au膜的光热加热进一步表征为注入电流的函数,因为加热速率由耗散功率(即LED的注入电流)决定。图3d总结了用不同厚度和不同注射电流的Au薄膜加热3分钟后溶液的温度(参见补充表S2)。

PCR 3.jpg

 

LED驱动的光热加热薄膜的金薄膜和PCR热循环。(

a) 不同厚度的金薄膜的吸收光谱。吸收 (%)=100–透射率 (%)– 反射率 (%)。液体的温度曲线 

b) 是注入电流为 500 mA 的 Au 膜厚度的函数,以及 

c) 使用 120 nm 厚的 Au 膜的 LED 注入电流的函数。使用了峰值波长为450 nm的蓝色LED。

d) 二维图,显示加热3分钟后不同厚度的金膜液体温度分布和LED注入电流;

e) 演示LED驱动的光子PCR热循环,包括三种不同的温度;94 °C (变性), 60 °C (退火) 和 72 °C (扩展)。

f) PCR热循环的精确温度控制和低温变化。94 °C、60 °C和72 °C时标准偏差的平均值分别为94.09±0.17 °C、59.94±0.13 °C和72.02±0.12 °C。发光二极管,发光二极管;聚合酶链反应,聚合酶链反应

 

通过λ-DNA的扩增验证了我们的光子PCR方法。在电泳PCR反应(如图4c所示)后,通过E-Gel 2%琼脂糖凝胶和SYBR Safe可视化扩增子®断续器.泳道1代表1 kb DNA标记,泳道2和3是来自不同循环数(0秒为94°C,62°C为0秒)的超快光子PCR的PCR产物,泳道4和5包含标准热循环条件(94°C为1秒,62°C为1秒),产生的阳性对照 60 次循环)通过台式热循环仪 (Bio-Rad C1000)断续器热循环仪,Bio-Rad实验室公司,赫拉克勒斯,加利福尼亚州,美国)。光子PCR产生了单个98 bp主波段(泳道2和3),表明使用我们的超快光子PCR方法成功扩增了λ-DNA。光子PCR扩增的PCR产物的弱条带强度可归因于与传统台式热循环仪相比扩增效率较低。目前,只有薄膜作为二维光热加热器,导致溶液中存在温度梯度,并且可能降低放大效率。通过利用PCR室中的三维底物对PCR混合物进行均匀的光热加热,可以改善这种限制。扩增时间和试剂消耗可以进一步减少,同时通过更快的分子扩散和均匀的溶液温度提高PCR反应的效率。

PCR 4.jpg


 

引用

海里斯·卡,特罗皮尼C,范因斯伯格M,杜林C,彼得里夫OI等。百万像素数字 PCR。纳特方法2011;8:649-651。

这项工作部分得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会(全球健康资助:OPP1028785)的资助,部分得到了全球研究实验室计划(2013-050616)的支持,该计划由韩国国家研究基金会资助,由科学,ICT(信息和通信技术)和未来规划部资助。我们 感谢 卡西克·普拉萨德 和 努斯拉特·莫拉 帮助 LabVIEW 为 光子 PCR 热 循环 仪 进行 编 程。

加州大学伯克利分校生物工程系, 94720, CA, 美国